用小剂量质粒提取试剂盒提取质粒前要做什么工作?
提取质粒操作过程:这个是那生产的试剂盒?
1将1~1.5ml过夜培养的细菌液加入1.5ml离心管中.
2于10,000rpm(8,000~10,000×g)离心30s,并弃去上清液.如有需要,可多次重复步骤1、2,以收集更多细菌菌体,但勿过量,以免影响提取质粒的质量.
3加250μlResuspensionBuffer,重悬细菌体沉淀,重悬后应该没有细菌团块.
4加250μl细胞Lysisbuffer,轻柔颠倒4~6次.不要剧烈振动,以防止基因组DNA被剪切.注意不要让反应持续超过5min,
5加350μlNeutralizationbuffer,立即轻柔颠倒离心管4~6次.溶液应该出现絮状物,但不会出现局部沉淀.
6于13,000rpm(>14,000×g)离心10min.如离心机转速不够可延长离心时间,直至形成紧密的白色沉淀.
7将步骤6离心后得到的上清液转移到Spincolumn内,于6,000rpm(≤6,000×g)离心1min,并弃去接液管内液体.
8向Spincolumn内加650μlWashBuffer,于12,000g离心30~60s,并弃去接液管内液体.
9重复第8步一次.
10再次于12,000g离心1min,然后将Spincolumn转移到无菌的1.5ml离心管中.如不进行该步离心,则无法保证离心柱内残液被彻底清除.
11向Spincolumn内加50μlElutionbuffer、去离子水或TE溶液,并于室温静置1min.可根据实验的实际需要决定洗脱液用量.
12于12,000g离心1min,1.5ml离心管内溶液中含有质粒DNA.